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[测序为什么要构建文库]真菌测序为什么进行20

2021-07-23adminROR体育0

[测序为什么要构建文库]基因组测序为什么要构建不同插入片段长的文库

问题:就好像要构建200bp,500bp,800bp,2kb,5kb,10kb,20kb这样,听到一种说法是200bp,500bp,800bp,这样的是来得到reads的,2kb,5kb,10kb,20kb这样的是在contigs补洞成scaffold时应用的,是这样吗?

请具体阐述现在全基因组测序用鸟枪法,把所有DNA打碎成短片段,测出所有片段的序列再用超级计算机进行拼接。

你说的是老方法,先构建大的长片段文库,这些长片段互相重叠,能涵盖全部基因组,即所谓的骨架scaffold。

然后在对文库里每一个克隆进行亚克隆,应该还进行亚亚克隆,得到可以直接测序的短片段克隆,即所谓的可以测序得到Reads的克隆。

每个Reads的序列拼接起来,逐级拼接,最后得出每一个长片段克隆的序列,最后进行长片段克隆的拼接,得到每一条染色体的序列。

实际上老方法就是分级克隆,再拼接,鸟枪法就是直接得到短片段,不经过克隆,对短片段直接测序、拼接。人类基因组计划最初使用老方法,后来一个公司使用了鸟枪法,最后两种方法同时完成。

补充一点:由于ShotGun法测序会出现在较多的重复测序结果,因此,小于100kbp的DNA片段测序工作使用Shot

[测序为什么要构建文库]真菌测序为什么进行20k文库构建

基因组DNA测序文库构建1.对收到的DNA样品进行检测,取2-3ul样品,用1%的琼脂糖胶检测,对于纯度不够(含RNA或蛋白)的DNA样品需要柱纯化后重新检测。

对于细菌基因组需要扩增16S全长序列,进行验证。对于噬菌体或者质粒样品,若用16S全长引物扩增,无目的条带则无细菌基因组污染,若出现目的条带则存在污染,需要去除后建库。

2.用Qubit检测DNA样品浓度。3.吸取部分DNA样品,用TE或ElutionBuffer稀释,终浓度在10ng/ul-30ng/ul之间,体积为130ul。

用Covaris破碎,破碎时请根据需要片段大小,按标准操作流程操作。4.样品足够多的情况下,可以取适量破碎后的产物进行PAGE胶或者琼脂糖胶检测。

5.对破碎后的产物进行柱式法(5倍体积的B3 100-200ul异丙醇)浓缩回收,加入50-100ul

TE或ElutionBuffer洗脱。回收产物用Qubit测值。6.修平和磷酸化搜一下:真菌测序为什么进行20k文库构建

[测序为什么要构建文库]同时对一个物种进行转录组测序和建立cDNA文库有什么好处

cDNA相比于转录组的优点是包含有该物种的全部转录本,可以便捷的克隆该物种的所需基因,而不必考虑时空表达的差异。

转录组的优点在于是某个特定时期的所有转录产物,可以用来研究某一生理条件或时空条件下该物种转录水平和正常情况下的差异。

[测序为什么要构建文库]二代测序为什么需要构建dna文库

1)测序文库的构建(LibraryConstruction)首先准备基因组(虽然测序公司要求样品量要达到200ng,但是Gnome

Analyzer系统所需的样品量可低至100ng,能应用在很多样品有限的实验中),然后将DNA随机片段化成几百碱基或更短的小片段,并在两头加上特定的接头(Adaptor)。

如果是转录组测序,则文库的构建要相对麻烦些,RNA片段化之后需反转成cDNA,然后加上接头,或者先将RNA反转成cDNA,然后再片段化并加上接头。

片段的大小(Insertsize)对于后面的数据分析有影响,可根据需要来选择。对于基因组测序来说,通常会选择几种不同的insert

size,以便在组装(Assembly)的时候获得更多的信息。2)锚定桥接(SurfaceAttachment

andBridgeAmplification)Solexa测序的反应在叫做flowcell的玻璃管中进行,flow

cell又被细分成8个Lane,每个Lane的内表面有无数的被固定的单链接头。上述步骤得到的带接头的DNA

[测序为什么要构建文库]建立基因文库的目的

问题:基因文库的概念中。受体菌是什么?为什么建立基因文库?将某种生物不同基因的许多DNA导入受体菌后,该DNA分子会不会自我复制、表达,为什么?

(根据描述回答,答偏无分。)cDNA文库的构建1.1cDNA文库构建的基本原理与方法cDNA文库是指某生物某发育时期所转录的全部

mRNA经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。经典cDNA文库构建的基本原理是用

Oligo(dT)作逆转录引物,或者用随机引物,给所合成的cDNA加上适当的连接接头,连接到适当的载体中获得文库。

其基本步骤包括:RNA的提取(例如异硫氰酸胍法,盐酸胍—有机溶剂法,热酚法等等,提取方法的选择主要根据不同的样品而定),要构建一个高质量的

cDNA文库,获得高质量的mRNA是至关重要的,所以处理mRNA样品时必须仔细小心。由于RNA酶存在所有的生物中,并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境,因此建立一个无

RNA酶的环境对于制备优质RNA很重要。在获得高质量的mRNA后,用反转录酶Oligo(dT)引导下合成

cDNA第1链,cDNA第2链的合成(用RNA酶H和大肠杆菌DNA聚合酶I,同时包括使用T4噬菌体多核苷酸酶和大肠杆菌

DNA连接酶进行的修复反应),合成接头的加入、将双链DNA克隆到载体中去、分析cDNA插入片断,扩增

cDNA文库、对建立的cDNA文库进行鉴定。这里强调的是对载体的选择,常规用的是λ噬菌体,这是因为λ

DNA两端具有由12个核苷酸的粘性末端,可用来构建柯斯质粒,这种质粒能容纳大片段的外源DNA。1.2

cDNA全长文库经典cDNA文库的构建虽然高效、简便,但文库克隆的片段一般较小,单个克隆上的DNA片段太短,所能提供的基因信息很少,大多需要几个克隆才能覆盖一个完整的全基因的

cDNA。为了克隆到真正的cDNA全长,建立富含全长的cDNA文库具有重要意义。为此,必须克服仅用mRNA

的PolyA尾合成以及由普通逆转录酶作用特点所导致的局限性。全长cDNA文库,是指从生物体内一套完整的

mRNA分子经反转录而得到的DNA分子群体,是mRNA分子群的一个完整的拷贝。全长cDNA文库不仅能提供完整的

mRNA信息,而且可以通过基因序列比对得到mRNA剪接信息,此外,还可以对蛋白质序列进行预测及进行体外表达和通过反向遗传学研究基因的功能等。

目前所报道的对全长文库的构建一般按照美国CLONTECH公司的SMARTcDNALibraryConstruction

Kit方法或GeneRacer试剂盒(Invitrogen,USA)使用说明进行。判断一个cDNA文库中的

cDNA序列是否是全长基因的cDNA,主要方法有以下几种。1.2.1直接从序列上评价5'端:如果有同源全长基因的比较,可以通过与其它生物已知的对应基因5'末端进行比较来判断。

如果无同源基因的新基因,则首先判断编码框架是否完整,即在开放阅读框的第1个ATG上游有无同框架的终止密码子;其次,判断是否有转录起始点,一般加在5'帽结构后有一段富含嘧啶的区域,或者是

cDNA5'序列与基因组序列中经过酶切保护的部分相同,则可以确定得到的cDNA的5'端是完整的。3'端:同样可以用其它生物已知的对应基因3'末端进行比较来判断,或编码框架的下游有终止密码子,或有1个以上的

PolyA加尾信号,或无明显加尾信号的则也有PolyA尾。1.2.2用实验方法证实可以通过引物延伸法确定5'端和3'端的长度,如:5'端

RACE,3'端RACE,或者通过NorthernBlot证实大小是否一致。1.3对cDNA文库的分析

对cDNA文库质量的评价主要有两个方面。第一方面为文库的代表性,cDNA文库的代表性是指文库中包含的重组

cDNA分子反映来源细胞中表达信息(即mRNA种类)的完整性,它是体现文库质量的最重要指标。文库的代表性好坏可用文库的库容量来衡量,它是指构建的原始

cDNA文库中所包含的独立的重组子克隆数。库容量取决于来源细胞中表达出的mRNA种类和每种mRNA序列的拷贝数,1个正常细胞含10000~30000种不同的

mRNA,按丰度可分为低丰度、中丰度和高丰度三种,其中低丰度mRNA是指某一种在细胞总计数群中所占比例少于0.5%时。

满足最低要求的cDNA文库的库容量可以用Clack-Carbor公式N=Ln(1-P)/(1-1/n)

计算(P为文库中任何一种mRNA序列信息的概率,通常设为99%;N为文库中以P概率出现细胞中任何一种

mRNA序列理论上应具有的最少重组子克隆数;n为细胞中最稀少的mRNA序列的拷贝数;T为细胞中表达出的所有

mRNA的总拷贝数)。第二方面是重组cDNA片段的序列完整性。在细胞中表达出的各种mRNA片段的序列完整性。

在细胞中表达出的各种mRNA尽管具体序列不同,但基本上都是由3部分组成,即5'端非翻译区,中间的编码区和3'端非翻译区。

非翻译区的序列特征对基因的表达具有重要的调控作用,编码序列则是合成基因产物—蛋白质模板。因此,要从文库中分离获得目的基因完整的序列和功能信息,要求文库中的重组

cDNA片段足够长以便尽可能地反应出天然基因的结构。2cDNA文库构建的其它类型2.1均一化cDNA

文库它是指某一特定组织或细胞的所有表达基因均包含其中,且在cDNA文库中表达基因对应的cDNA的拷贝数相等或接近。

WEISSMAN早就提出了可以通过基因组DNA饱和杂交的原理将cDNA文库进行均一化的理论。但该理论一直以来都被认为不能应用于实际。

其主要限制因素是难以提供足量的极低表达丰度的cDNA用于饱和杂交,从而可能会造成部分基因的cDNA的丢失。

20年前,基于DNA-RNA杂交的研究就已经将基因的转录水平分为高中低3类。随后研究进一步表明,绝大多数基因是处于中等或低等表达丰度的,在单个细胞中含有近1~15个拷贝,而高丰度表达基因的转录产物在单个细胞中最高可达5000个左右拷贝,约占总表达量的25%。

这种基因表达能力上的巨大差异成了获得一个具有完整代表性的cDNA文库的障碍,其表达量上的巨大差异更为大规模研究增添了困难。

对单一组织的cDNA文库而言,高拷贝基因序列的大量存在给基因的筛选和鉴定带来不必要的浪费,尤其是在大规模的

EST测序中。均一化cDNA文库是克服基因转录水平上巨大差异给文库筛选和分析带来障碍的有效措施,有利于研究基因的表达和序列分析。

现在,在构建均一化的cDNA文库中至少有2种主要的观点:一种是基于复性动力学的原理,高丰度的cDNA

在退火条件下复性的速度快,而低丰度的cDNA复性要很长时间,从而可以通过控制复性时间来降低丰度;另一种是基于基因组

DNA在拷贝数上具有相对均一化的性质,通过cDNA与基因组DNA饱和杂交而降低在文库中高拷贝存在的cDNA

的丰度。第一种方法的掌握对技术的要求比较高,对多数人而言需要多次摸索才能找到最适条件;而后一种方法易于掌握,但有研究者根据复性动力学的原理也提出了其不利因素,即采用基因组

DNA饱和杂交的方法会因为低拷贝的表达基因拷贝数少而无法被杂交上。目前已报到的均一化cDNA文库多是根据第二种原理构建的,常用策略有基于

PCR技术利用cDNA多次复性mRNA-cDNA杂交等。有研究报道,针对各自选择的高表达靶序列进行分析后,均一化处理后文库的高丰度表达

cDNA是处理前的0.3%~2.5%,基本满足节约筛选的要求。均一化cDNA文库具有以下4方面的优点:第一,在经济上具有广泛的应用空间,可以节约大量试验成本。

第二,增加克隆低丰度mRNA的机会,适用于分析各种发育阶段或各种组织的基因表达及突变检测。第三,与原始丰度的

mRNA拷贝数相对应的cDNA探针与均一化的cDNA文库作杂交,可以估计出大多数基因的表达水平及发现一些组织特异的基因。

而以往的文库构建,忽略了mRNA丰度的影响。第四,可以用于遗传图谱的制作和进行大规模的原位杂交,作为优化的文库系统还可以用于大规模的测序或芯片制作等研究。

2.2差减cDNA文库(SubtractivecDNAlibrary)差减文库也称扣除文库,使用两种遗传背景相同或大致相同但在个别功能或特性上不同的材料(如不同基因处理细胞系或植物的近等基因系等)提取

mRNA(或反转录后合成cDNA),在一定条件下用大大过量不含目的基因的一方作为驱动子(Driver

)与含有目的基因的试验方(Tester)进行杂交,选择性的祛除两部分共同基因杂交形成的复合物,往往进行多次的杂交—祛除过程,最后将含有相关目的基因的未杂交部分收集后,并连接到载体形成文库。

消减杂交是构建差减cDNA文库的核心,差减文库是否构建成功很大程度上决定于差减杂交的效率。差减杂交的方法主要有(1)羟基磷灰石柱层析法

(HAP);(2)生物素标记、链亲和蛋白结合排除法;(3)限制性内切酶技术相结合的差减方法;(4)差减抑制杂交法

(SSH);(5)磁珠介导的差减法(MAST),其中SSH法最为常用。抑制性消减杂交技术(Suppression

SubtractiveHybridization,SSH)是DIATCHENKO等人于1996年依据消减杂交和抑制

PCR发展出来的一种分离差异表达基因的新方法,主要用于分离两种细胞或两种组织的细胞中的差异表达基因。

它主要是利用抑制PCR对差减杂交后丰度一致的目的材料中两端连有不同接头的差异表达片段进行指数扩增,而两端连接上同一接头的同源双链片段仅呈线形扩增,从而达到富集差异表达基因的目的。

因此应用该技术能够对两个有差异表达的材料(细胞或组织)高、中、低丰度目的基因都进行有效、快速、简便克隆。

近年来已成功应用于植物发育、肿瘤与疾病、以及外界因子诱导组织细胞中相关的应答基因的分析和克隆。2.3

固相cDNA文库构建cDNA的固相合成是人们早为熟知的技术,但局限之处oligo(dT)与纤维素胶粒或磁珠的结合比较牢固,将

cDNA洗脱下来时得率不是很高,而且以后的反应步骤也不能都在介质上进行,这可能是该技术应用并不十分广泛的原因。

最近THOMASROEDE提出了一种新的cDNA文库固相合成方法(THOMASROEDE,1998),克服了以前文库构建中存在的缺点,所用的酶和试剂与传统方法完全相同,不同的是

cDNA的合成和修饰均在固相支持物—磁珠上完成。cDNA通过一个生物素固定在链霉素偶联的磁珠上,这样在反应过程中就可以简便而迅速的实现酶和缓冲液的更换,因此它将快速与高质量的文库构建结合在一起(构建文库只需1

d),并且构建的文库适合大多数的研究目的。固相cDNA合成法的主要优点是可以简便cDNA合成的操作。

在进行缓冲液更换时既没有cDNA的丢失之忧,也无其它物质污染之忧。另外,用此方法可以得到真实的代表性文库,它包含有短小的

cDNA,这是因为在克隆之前省去了分级分离的步骤。总之,固相法结合了传统的cDNA合成的优点并弥补了其不足。

这种方法简便易行,可靠低廉,所建文库高质量,因此它可能会替代目前应用的cDNA文库操作方法。另外,最近发展起来的微量

RNA的cDNA构建,是使用PCR技术,在实验室条件下扩增的mRNA的cDNA量,其PCR检测的灵敏度远远大于反转录

PCR(RT-PCR)法。微量RNA的cDNAPCR文库的构建可为有关微量活性物质遗传基因的研究提供方便。

3cDNA文库应用于分离新基因的方法发现并分离克隆新基因始终是分子生物学研究的主要任务和目的,虽然cDNA

文库的用途很多,但是,应用于分离新基因是其最重要的用途。前述的不管是哪种类型的cDNA文库,都可以用于分离新基因,只是使用的方法有差异。

分离方法主要有两种:第一,对于非全长cDNA文库,即不管是经典的cDNA文库方法或差减法构建的cDNA

文库,需要利用已经获得的新cDNA序列片段,通过RACE方法获得新基因的全长序列。第二,利用全长cDNA

文库与目的基因片段作为探针的杂交筛选。3.1从非全长cDNA文库中筛选新基因3.1.1RACE法RACE

文库即快速扩增cDNA末端法(RapidAmplificationofcDNAEnd,RACE)只需知道

mRNA内很短的一段序列即可扩增出其cDNA的5'(5'RACE)和3'端(3'RACE)。该法的主要特是利用一条根据已知序列设计的特异性引物和一条与

mRNA的PolyA(3'RACE)或加至第一链cDNA3'端的同聚尾(5'RACE)互补的通用引物,由于同聚体并非良好的

PCR引物,同时为了便于RACE产物的克隆,可向同聚体引物的5'端内加入一内切酶位点。所用的cDNA

模板可以使用多聚dT引物延伸合成(3',5'-RACE均可)。当RACEPCR产物为复杂的混合物时,可取部分产物作模板,用另一条位于原引物内侧的序列作为引物与通用引物配对进行另一轮

PCR(巢式PCR)。早在1988年,FROHMAN等即用此方法成功地获得了4种mRNA的5'合3'末端序列。

迄今已有几种改良的RACE方法,通过修饰与优化,与最初的FROHMAN报道有所不同:(1)BARSON

等采用锁定寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸引物“锁定”基因特异性序列的3'末端与其Poly(A)尾的连接处,进行第1条

cDNA链的合成,消除了在合成第1条cDNA链时寡聚(dT)RNA模板Poly(A)尾任何部位结合而带来的影响。

(2)EDWARDS和TROUTT小组利用T4RNA连接酶把寡核苷酸连接到单链cDNA的5'末端,然后用一个3'末端特异性引物和一个锚定引物就可以直接对锚定连接的

cDNA进行体外PCR扩增和克隆。随后,BERTLING等又用DNA连接酶代替RNA连接酶。这些方法都避免了在第2条

cDNA链内同聚序列区互补而导致截断cDNA的产生。(3)MARUYAMA等提出cRACE法,采用的引物为基因特异性的,所以非特异性

PCR产物基本上不会产生。Clontech等公司也根据RACE法的更新,相继推出了RACE的相应试剂盒,为克隆

cDNA提供了方便的工具。最近HUANG等人即用RACE试剂盒克隆了一种含有类植物血凝素免疫受体ITIM。

3.1.2用PCR法从cDNA文库中快速克隆基因通过对文库的筛选或适用简并引物进行PCR反应,常常只能获得不完整的

cDNA片段。为了得到cDNA全长,常常要重新筛选文库。重新筛选文库工作量大,RACE虽然为此提供可方便,但应用该方法需重新提取

mRNA和反转录。而用PCR法从cDNA文库中快速克隆基因的方法,只需提取λ噬菌体DNA,按保守序列设计

PCR引物便可将未知片段进行克隆。特别是在基因的两端变异较大而中间某区域保守的情况下,用PCR法很容易获取

cDNA的全长。同一转录产物,又是存在着不同的拼接方式,通过筛库的办法同时将不同拼接方式的克隆筛选出来可能性较小,而使用

PCR扩增后,有利于观察到不同的拼接方式。另外,为研究基因在不同组织中表达情况,常根据差异显示法找出特异的

mRNA。3.2从全长cDNA文库中进行杂交筛选3.2.1标记探针cDNA文库筛选法cDNA文库通常涂抹到母盘培养基上,然后再把这些菌落的样品吸印到硝酸纤维素膜或尼龙膜上;这时加入标记的探针,如果出现杂交信号,那么从母盘上就可以把包含杂交信号的菌落分离、培养出来。

以此筛选出阳性克隆,进行序列分析,以获得cDNA全长。该方法能避免PCR扩增的非特异性扩增或错配,是一种比较准确可靠的

cDNA克隆方法。主要缺点是克隆过程需要一系列的酶促反应、产率低、费时长、工作量大。该方法适合于表达丰度高的基因的筛选分离。

用于做标记探针的DNA片段可以是其它生物的基因片段,在这种情况下筛选出来的基因往往是已分离基因的同源基因;如果用于做标记探针的

DNA片段是通过新分离蛋白质的氨基酸反推设计的DNA序列,或者是特异分子标记子DNA序列,那么可以筛选得到新功能基因。

3.2.2反式PCR反式PCR克隆cDNA全长的基因原理是:双链cDNA合成后进行尾—尾连接,环化的

cDNA用位于已知序列内的限制性内切酶酶切位点造成缺口或用NaOH处理使之变性,然后用2条基因特异性引物对重新线性化或变性的

cDNA进行扩增。反式PCR的优势在于,它采用了2条基因特异性引物,因此不易产生非特异性扩增。该方法可以快速、高效地扩增

cDNA或基因组中已知序列两侧位置的片段。4小结随着生物及信息技术的迅速发展,寻找新基因、克隆新基因、进而研究基因的功能已成为功能基因组研究中的一项重要工作。

在过去寻找新基因的方法中,以消减杂交、mRNA差异显示,cDNA的代表性差异显示分析法、差异消减展示等方法应用最广。

这些方法在新基因的发现方面都各有其独特的优势,可寻找出一些差异表达序列,但这些差异表达序列大部分情况都是不完整的基因。

目前,比较可行而且应用较多的方法主要还是cDNA文库的筛选。一方面cDNA文库只代表一定时期一定条件下正在表达的基因,是整个真核基因组中的少部分序列,因此

cDNA克隆的复杂程度比直接从基因组克隆的要小得多;另一方面由于每个cDNA克隆只代表一种mRNA序列,因此在基因克隆过程中出现假阳性的概率比较低,所以

cDNA文库的构建已成为当前分子生物学研究和基因工程操作的基础。本文涉及到的有关cDNA文库构建方法,是目前比较常用的,这些方法各有优缺点,研究者应根据自己的实际情况,选择合适的技术,已达到自己预期的目的。

受体是dna载体进入体内复制的细菌建立基因文库可以存各种基因方便使用要用就把dna密密找出来限制性内切酶

把dna导入载体载体导入受体受体可以是生物或细胞受体通过dna翻译和转录合成蛋白质蛋白质表达相应的效果